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表明在Lj表面表达的蛋白酶PrtB融合蛋白能诱导出

  法国的GrangetteC等对经鼻传递重组的人源植物乳杆菌作为表达宿主能否激发免疫反应进行了研究。构建了能在细胞质表达不同水平的破伤风毒素47kD段C(TTFC)质粒。证明经鼻内途径免疫小鼠,所有重组菌株均能激发很高的与抗原剂量有关的全身性IgG(IgG1,IgG2b和IgG2a)反应。ELISA分析显示,活的重组乳杆菌免疫鼠和丝裂霉素处理重组乳杆菌免疫鼠的IgG滴度没有有意义的差别。但是,仅在菌株产生最高剂量抗原时,才对致死剂量的破伤风毒素提供保护作用,使用活菌株免疫时保护作用大。在支气管肺灌洗中检测到TTFC-特异性黏膜IgA反应,在子宫颈的淋巴结检测到抗原特异性的T-细胞反应。在每次免疫时(24小时间隔),接受双剂量的细菌免疫的鼠的两种反应均较高。上述结果表明,经鼻免疫重组的乳酸杆菌能诱导特异性的体液和黏膜抗体反应以及细胞免疫反应[1]。

  瑞士免疫和变态反应研究院Scheppler等研究发现,约氏乳酸杆菌(Lj)可在体外一个模拟的胃肠道环境里部分生存,认为其可作为口服疫苗的传递系统。他们将从德氏乳杆菌保加利亚种中分离的细胞壁锚定蛋白酶PrtB作为抗原模型,利用一个新的载体系统,证明在Lj表面表达蛋白酶PrtB和融合蛋白TTmim-PrtB。小鼠口服免疫表达融合蛋白TTmim-PrtB重组Lj能诱导全身性抗Lj和蛋白酶PrtBIgG反应,但没有诱导出抗破伤风毒素mimotope反应,认为mimotope没有足够的免疫原性。有趣的是,上述免疫还诱导出蛋白酶PrtB特异性的排泄物的IgA反应,表明在Lj表面表达的蛋白酶PrtB融合蛋白能诱导出全身和局部黏膜免疫反应[2]。

  新家坡国立大学的微生物学系的HoPS等选择干酪乳杆菌株Shirota作为细菌载体,开发一个抗冠状病毒的活黏膜疫苗。传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的刺突糖蛋白S的75kD段作为冠状病毒抗原模型,克隆到乳酸菌和大肠杆菌穿梭载体,使其在重组的乳酸杆菌分泌表达。对BALB/c鼠口服免疫能表达刺突糖蛋白S的75kDa的重组LcS后,能同时诱导局部的黏膜和全身性抗TGEV免疫反应。口服免疫后32天的抗体达到最高滴度IgG(8.38+/-0.19ng/ml血清)和IgA(64.82+/-2.9ng/ml肠内水)。诱导出的抗体对TGEV的感染有中和作用[3]。

  人类黏膜佐剂应用的局限性,开发一个有效的抗幽门螺杆菌(可引起慢性胃炎,消化性溃疡,胃腺癌)感染的疫苗仍然是一个具有挑战性的问题。瑞士CorthesyB等对产幽门螺杆菌尿素酶UreB亚单位的乳酸杆菌,将该抗原传递到胃肠道的能力进行了评价。对小鼠经口腔注入三倍剂量的重组植物乳酸杆菌NCIMB8826,重组的表达UreB同基因型的细胞壁突变体(alr(-)MD007菌株)或混合重组体rUreB/CT(表达UreB和霍乱毒素)作为控制。利用ELISA检测尿素酶特异性血清IgG和IgA。结果胃内免疫重组乳酸杆菌和rUreB/CT均能激发UreB特异性抗体。猫幽门螺杆菌挑战后,只有接受重组突变菌株MD007或rUreB/CT鼠胃部猫幽门螺杆菌的量降低[4]。

  巴西的OliveiraML等在不同类型的乳酸菌(如乳酸乳球菌,干酪乳杆菌,植物乳杆菌,瑞士乳杆菌)中表达肺炎链球菌PsaA抗原。将上述的表达载体经鼻接种C57Bl/6鼠,检测其诱导全身(血清IgG)和黏膜(唾液,鼻和支气管洗液IgA)抗PsaA抗体的反应。tisMG1363免疫鼠后诱导出非常低水平的IgA和IgG,可能是因为该菌株表达PsaA量低,且在鼻黏膜滞留时间短的原因。另外三种乳酸杆菌能在鼻黏膜滞留3天,产生相似量的PsaA蛋白(150-250ng/109CFU)。但只有植物乳杆菌NCDO1193和瑞士乳杆菌ATCC15009激发出高水平的抗体(IgA和IgG)。肺炎链球菌感染后,重组乳酸杆菌疫苗能降低鼻黏膜中肺炎链球菌的量,但重组乳酸乳球菌疫苗不能降低鼻黏膜中肺炎链球菌的量。结果表明,某些乳杆菌适合成为黏膜疫苗试验的载体[5]。

  激发抗人乳头状瘤病毒16的E7(HPV16E7)蛋白特异性免疫反应对子宫颈黏膜上表达HPV16E7癌细胞的根除是十分重要的。韩国生物科学和生物技术研究所蛋白组学研究实验室PooH等为了达到从口腔传递E7抗原,以诱导出黏膜的免疫反应,利用一个新的表面蛋白展示系统(将源自枯草杆菌的gamma-PGA合成酶复合物A,PgsA作为锚定基),在干酪乳酸杆菌的表面表达HPV16E7抗原。经Westernblot,流式细胞术和免疫荧光电镜证明表面表达HPV16E7蛋白后,对小鼠经口腔接种L.casei-PgsA-E7。结果:口腔免疫后E7-特异性血清IgG和黏膜IgA产量增加,加强免疫后抗体水平显著增加。加强免疫后,脾细胞中淋巴细胞和分泌IFN-γ细胞记数增加,阴道淋巴细胞上清IFN-γ增加,表明全身和局部细胞免疫显著增加。基于E7鼠肿瘤模型,与接受L.casei-PgsA鼠相比,经口腔接受L.casei-PgsA-E7鼠肿瘤的尺寸减小,生存率增加。这些结果表明,小鼠经口腔服用表面表达E7蛋白乳酸杆菌能诱导细胞免疫和抗肿瘤效应[6]。

  预防SARS-CoV感染,诱导黏膜免疫可能是十分重要的。为了安全有效的将病毒抗原传递到黏膜免疫系统,韩国Bioleaders公司LeeJS等开发了一个新的在乳酸菌表面表达蛋白展示系统(将源自枯草杆菌的gamma-PGA合成酶复合物A,PgsA作为锚定基)。在干酪乳酸杆菌的表面稳定的表达融合蛋白[PgsA和S蛋白片段SA(2-114)和SB(264-596)]。通过细胞分馏分析,流式细胞术和免疫荧光电镜,验证融合蛋白的表面定位。对小鼠经口腔和鼻接种重组的干酪乳酸杆菌可激发高水平的鼠血清的IgG和黏膜IgA。更重要的是,这些抗体对严重的急性呼吸道综合症(SARS)假病毒有中和活性。口腔免疫的鼠中和抗体反应大于经鼻免疫鼠。在S蛋白鉴定了三个新的中和表。上述结果显示,黏膜免疫重组的,表面表达SARS-相关冠状病毒S蛋白干酪乳酸杆菌能激发抗病毒的保护性免疫反应[7]。

  复旦大学上海医学院附属妇产科医院暨妇产科研究所姚晓英等用表达hCGβ的重组乳酸杆菌活疫苗经阴道黏膜途径免疫不同品系小鼠产生抗hCGβ免疫应答及机制。方法用108、109、1010个重组乳酸杆菌LbhCGβ经阴道黏膜免疫6~8周龄雌性BALB/c和C257BL/6小鼠。3周后用相同剂量加强免疫一次。间接ELISA检测初次免疫后2~8周血清和阴道灌洗液中抗hCGβIgG和IgA抗体滴度。分离免疫小鼠脾、子宫、阴道黏膜的淋巴细胞,流式细胞仪分析其中B和T细胞的增殖情况,ELISPOT分析分泌抗hCGβIgG和IgA抗体分泌细胞的克隆数。结果对不同品系小鼠黏膜接种109、1010LbhCGβ可诱导相近的免疫应答;而108诱导的抗体滴度较低。在加强免疫后,109和1010LbhCGβ诱导的抗血清中和hCGβ抗原的能力100ng/ml。LbhCGβ阴道黏膜免疫后T和B细胞增殖;脾脏、子宫及阴道内均存在抗hCGβIgG及IgA抗体分泌细胞。结论重组乳酸杆菌活疫苗LbhCGβ可经阴道黏膜免疫诱导有效的免疫应答,产生的应答与免疫剂量呈正相关[5]。

  [8]表达hCGβ的重组乳酸杆菌经阴道免疫小鼠后的体液免疫应答.中华微生物学和免疫学杂志.2006,26(7):659-664.

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